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細胞知識：外泌體的提取方法
外泌體的提取是生物醫學研究中至關重要的一步，它們作為細胞間通信的重要媒介，承載著豐富的生物信息。本文將詳細介紹外泌體的提取方法，涵蓋經典的傳統方法以及近年來發展起來的新技術，旨在為科研人員提供全面而實用的指導。
一、超速離心法
超速離心法（UC）是外泌體提取的經典方法，通過不同轉速的離心步驟，逐步去除細胞、細胞碎片及大分子物質，最終獲得外泌體沉淀。該方法主要分為差速超速離心（DUC）和密度梯度超速離心兩種。
1. 差速超速離心（DUC）
差速超速離心通過一系列不同轉速的離心步驟，逐步分離出外泌體。首先，將收集的細胞培養上清或生物體液在300×g離心10分鐘，去除細胞和大的細胞碎片。然后，將上清轉移至新的離心管，以2000×g離心10分鐘，進一步去除殘留的細胞碎片和微囊泡。最后，將上清再次轉移至超速離心管，以100,000-120,000×g離心60-90分鐘，使外泌體沉淀在管底。需要注意的是，由于細胞外液具有高度異質性，DUC可能導致非理想的外泌體聚集，因此可能需要進一步純化。
2. 密度梯度超速離心
密度梯度超速離心是對DUC的改進，通過在樣品中加入具有密度梯度的惰性介質（如蔗糖或氯化銫），利用顆粒密度與介質密度的差異進行分離。該方法適用于沉降系數略有差異的顆粒的分離，可以獲得更純化的外泌體。然而，密度梯度超速離心需要配制惰性梯度介質溶液，操作相對繁瑣，且不能完全依賴于密度差異進行分離，對于具有與外泌體相似浮力密度但大小不同的顆粒，其分離效果有限。
二、超濾法
超濾法（UF）是一種基于尺寸的隔離技術，使用具有指定孔徑或截留分子量（MWCO）的膜來分離預定尺寸范圍內的顆粒。超濾法具有處理時間短、不需要特殊設備的優點，但膜堵塞是一個值得注意的問題。
1. 串聯配置的超濾
串聯配置的超濾通過兩層膜進行過濾，大囊泡（包括細胞碎片、凋亡小體和細胞）被困在200nm的膜中，而直徑在20-200nm范圍內的囊泡則保留在下方20nm的篩選膜中。這種方法可以有效地去除大顆粒物質，但需要注意膜的選擇和更換，以避免堵塞。
2. 連續超濾
連續超濾則通過多個過濾器進行逐步過濾，首先通過1000nm過濾器去除大顆粒物質，然后通過500-kD的過濾器去除游離蛋白質，最后通過200nm過濾器收集直徑在50-200nm范圍內的外泌體。連續超濾可以進一步提高外泌體的純度，但同樣需要注意膜堵塞的問題。
三、切向流過濾（TFF）
切向流過濾（TFF）是一種錯流過濾形式，通過切向流分量破壞濃差極化層的形成，顯著降低滲透通量，有效減少潛在的堵塞。TFF可以提高外泌體的產量和生物活性，同時保持批次間的一致性。此外，TFF還適用于處理大量樣品，且不需要額外的設備。
四、尺寸排阻色譜（SEC）
尺寸排阻色譜（SEC）使用多孔凝膠過濾聚合物作為固定相，利用顆粒大小進行分離。SEC具有分離純度高、保持外泌體完整性和天然生物活性的優點，適用于小樣本量的分離。此外，SEC還可以根據所用材料的不同孔徑產生特定的外泌體子集。然而，SEC無法避免類似大小的污染物的存在，且總收益較低。為了提高分離效果，可以將SEC與其他方法（如DUC）結合使用。
五、PEG-base沉淀法
PEG-base沉淀法利用聚乙二醇（PEG）等聚合物通過劫持外泌體周圍的水分子來創造疏水微環境，迫使外泌體在低速離心下離開溶液并沉淀。該方法具有簡單、可擴展、產量高、外泌體不變形等優點，且無需額外設備即可用于大量樣品的處理。然而，PEG-base沉淀法獲得的外泌體純度較低，存在可溶性非外泌體蛋白、病毒粒子、免疫復合物等污染物的共沉淀問題。因此，在使用該方法時需要注意對提取物的進一步純化和鑒定。
六、磁珠免疫法
磁珠免疫法利用外泌體特異性的抗體標記的磁珠與外泌體結合，然后通過磁力作用將磁珠（結合外泌體）吸附在管壁一側，棄去上清后洗滌磁珠-外泌體復合物，最后通過加入洗脫緩沖液將外泌體從磁珠上洗脫下來。該方法具有高度的特異性和靈敏度，適用于對外泌體進行定性和定量分析。然而，磁珠免疫法需要制備特異性的抗體標記磁珠，且操作相對繁瑣。
七、試劑盒提取法
試劑盒提取法是一種便捷的外泌體提取方法，其原理主要基于試劑與外泌體的結合和沉淀。使用試劑盒提取外泌體時，需要按照說明書操作，將適量的沉淀試劑加入樣本中混合均勻后靜置過夜，然后離心收集沉淀并用PBS重懸。試劑盒提取法具有操作簡便、快速、適用于大量樣本處理的優點。然而，不同試劑盒的提取效率和純度可能存在差異，因此在使用前需要對試劑盒進行篩選和優化。
綜上所述，外泌體的提取方法多種多樣，每種方法都有其獨特的優點和局限性。在選擇提取方法時，需要根據實驗目的和樣本特點進行綜合考慮和選擇，并結合實際情況進行優化和改進。同時，在提取過程中需要嚴格遵守操作規范，確保提取物的質量和純度，為后續的實驗研究提供可靠的基礎。
